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產(chǎn)品選擇指南

技術(shù)服務(wù)信息

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Cas9-sgRNA細(xì)胞納米囊泡制備
品牌 Code No. 產(chǎn)品名稱 包裝量 價格（元） 說明書 數(shù)量
Clontech 632612 Guide-it CRISPR/Cas9 Vector System 1 System ￥4,859
Clontech 632613 Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System 1 System ￥9,710
Clontech 632616 Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set 10 Rxns ￥7,470
Clontech 632617 Gesicle Producer 293T Cell Line（本品僅限北京地區(qū)銷售） 1 ml ￥7,959
無標(biāo)題文檔
 
 
          基因敲除    
          ↗ 編輯效率檢測 → 細(xì)胞基因型確認(rèn) → Indel序列確認(rèn)
sgRNA設(shè)計(jì)工具 → sgRNA合成及篩選 → CRISPR-Cas9導(dǎo)入方法            
  基因敲入        
          ↘ 基因敲入檢測        
 
 
Guide-it™CRISPR/Cas9 Gesicle Production System
· 細(xì)胞來源的納米囊泡（Gesicle），可用于直接導(dǎo)入Cas9-sgRNA
· 轉(zhuǎn)染效率低的哺乳動物細(xì)胞（分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞、iPS細(xì)胞）也可實(shí)現(xiàn)有效的基因編輯
· Cas9蛋白質(zhì)/sgRNA復(fù)合物可以快速從細(xì)胞內(nèi)消除，降低脫靶效應(yīng)
 
■ 產(chǎn)品說明：
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System用于制備Cas9/sgRNA Gesicle，Cas9/sgRNA Gesicle是可以將Cas9蛋白質(zhì)/sgRNA復(fù)合物導(dǎo)入到哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞來源的納米囊泡（Gesicle）。與采用質(zhì)粒或者病毒載體相比較，采用Cas9/sgRNA Gesicle進(jìn)行基因編輯實(shí)驗(yàn)，可以實(shí)現(xiàn)在廣泛細(xì)胞類型中高效導(dǎo)入Cas9蛋白質(zhì)/sgRNA復(fù)合物，從而提高基因編輯效率。同時，可以嚴(yán)格控制用于細(xì)胞的Cas9蛋白質(zhì)/sgRNA復(fù)合物的劑量和持續(xù)時間，從而降低脫靶效應(yīng)。
 
■ CRISPR／Cas9 Gesicle特點(diǎn)：
· 適用于多種細(xì)胞類型
   可在分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞、原代細(xì)胞、細(xì)胞株、iPS細(xì)胞等多種細(xì)胞類型中進(jìn)行基因編輯（圖4）
· 高活性Cas9蛋白質(zhì)／sgRNA確保有效的細(xì)胞導(dǎo)入
   Cas9蛋白質(zhì)／sgRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞，無需轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，導(dǎo)入后可以直接開始基因編輯
· 實(shí)現(xiàn)在需要的時候進(jìn)行基因編輯
   可以嚴(yán)格控制Cas9蛋白質(zhì)/sgRNA復(fù)合物的劑量和持續(xù)時間，與采用質(zhì)粒或者病毒載體導(dǎo)入系統(tǒng)進(jìn)行
   基因編輯相比較，降低了脫靶效應(yīng)
 
■ CRISPR／Cas9 Gesicle原理：
圖1． Cas9/sgRNA Gesicle制備和靶細(xì)胞導(dǎo)入
 
(Step 1) 將誘導(dǎo)Gesicle形成的質(zhì)粒預(yù)混液，靶特異sgRNA表達(dá)載體和Cas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至Gesicle Producer 293T Cell Line (Code No. 632617)中。(Step 2) 利用Clontech iDimerize系統(tǒng)技術(shù)原理，借助與gesicle表面的膜結(jié)合紅色熒光蛋白質(zhì)CherryPicker之間的相互作用， iDimerize誘導(dǎo)配體將Cas9-sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物載入到gesicle中。(Step 3) 攜帶紅色熒光標(biāo)記的Gesicle裝配完成并從制備細(xì)胞中釋放出來，收集培養(yǎng)基上清液，獲得Cas9-sgRNA Gesicle濃縮儲液。(Step 4) 收集獲得的Gesicle適用于廣泛細(xì)胞類型，可將靶細(xì)胞瞬時標(biāo)記為紅色并將Cas9-sgRNA復(fù)合物釋放至靶細(xì)胞中。由于Cas9蛋白質(zhì)C端有核定位信號（NLS），同時靶細(xì)胞培養(yǎng)液中沒有dimerizer誘導(dǎo)配體，因此可以確保Cas9-sgRNA復(fù)合物與紅色熒光蛋白質(zhì)分離之后可以轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。
 
圖2．Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System實(shí)驗(yàn)流程
 
■ 實(shí)驗(yàn)例
圖3. 脫靶效應(yīng)比較
 
比較采用Cas9-sgRNA Gesicle和質(zhì)粒系統(tǒng)導(dǎo)入sgRNA所帶來的脫靶效應(yīng)。凝膠電泳結(jié)果、Guide-it™ Mutation Detection Kit檢測結(jié)果以及測序結(jié)果均表明，采用Cas9-sgRNA Gesicle導(dǎo)入sgRNA時在潛在脫靶位點(diǎn)檢測不到明顯的脫靶效應(yīng)，而采用質(zhì)粒系統(tǒng)導(dǎo)入sgRNA時在靶基因位點(diǎn)EMX1和潛在脫靶位點(diǎn)均可檢測到基因突變。
 
圖4. 不同細(xì)胞類型中基因敲除效率比較
 
建立整合ZsGreen1表達(dá)框的不同細(xì)胞系，采用Cas9-sgRNA Gesicle（sgRNA以ZsGreen1為靶基因）處理細(xì)胞系，流式細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果分析。以添加不同量的ZsGreen1為靶基因的Cas9-sgRNA Gesicle（添加量分別為10 μl、20 μl、30 μl）處理組為實(shí)驗(yàn)組、以轉(zhuǎn)染Cas9/sgRNA表達(dá)質(zhì)粒處理組作為對照組，流式細(xì)胞儀檢測基因敲除效率。
在Jurkat等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型中，Cas9-sgRNA Gesicle的Cas9-sgRNA導(dǎo)入效率和ZsGreen1基因敲除效率要優(yōu)于Cas9/sgRNA表達(dá)質(zhì)粒。
 
圖5.成功敲除hiPS細(xì)胞中的CD81基因
 
以人CD81為靶標(biāo)設(shè)計(jì)sgRNA，采用Gesicle Producer 293T Cell Line制備產(chǎn)生含有Cas9-sgRNA復(fù)合物的細(xì)胞納米囊泡，收集Cas9-sgRNA Gesicle并將其添加至48孔板培養(yǎng)的未分化Cellartis human iPS cell line 18（Code No. Y00305）。Cellartis human iPS cell line 18以Cellartis DEF-CS Culture System（Code No. Y30010）為培養(yǎng)體系，培養(yǎng)6 hr和24 hr后更換為不含有Gesicle的DEF-CS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天。未添加Gesicle處理并且采用相同培養(yǎng)條件培養(yǎng)的Cellartis human iPS cell line 18作為實(shí)驗(yàn)對照組。通過流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)Gesicle處理和未經(jīng)Gesicle處理的Cellartis human iPS cell line 18, 采用FITC標(biāo)記的CD81抗體檢測細(xì)胞表面CD81的表達(dá)情況。
Panel A. 未經(jīng)處理的Cellartis human iPS cell line 18（左）和FITC標(biāo)記的CD81抗體檢測未經(jīng)Gesicle處理的Cellartis human iPS cell line 18（右）。 Panel B. FITC標(biāo)記的CD81抗體檢測經(jīng)Gesicle處理6 hr（左）和24 hr（右）的Cellartis human iPS cell line 18。
流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明， 經(jīng)Cas9/sgRNA Gesicle處理6 hr 后，CD81基因敲除效率為43%；經(jīng)Cas9/sgRNA Gesicle處理24 hr 后，CD81基因敲除效率為49%。
 
■ 產(chǎn)品組份
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Production System（Code No. 632613）
1. Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Set（ Code No. 632616）
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 1 (green cap) 10 vials
Guide-it CRISPR/Cas9 Gesicle Packaging Mix 2 (yellow cap) 10 vials
A/C Heterodimerizer (500 nM in Ethanol) 50 μl
Protamine Sulfate (4 mg/ml) 200 μl
 
2. pGuide-it-sgRNA1 Vector System（ Code No. 632612）
a．pGuide-it-sgRNA1 Vector (Linear) (7.5 ng/μl) 20 μl
b．Guide-it Ligation Components v2  
    DNA Ligation Mighty Mix 50 μl
    Guide-it Oligo Annealing Buffer 1.5 ml
    Guide-it Control Annealed Oligos v2 (100 fmol/μl) 10 μl
    Guide-it Sequencing Primer 1 (100 pmol/μl) 10 μl
    PCR-Grade Water 1 ml
c．Stellar Competent Cells（ Code No. 636763）  
    Stellar Competent Cells (100 μl/tube) 10 tubes
    SOC Medium (1 ml/tube) 10 tubes
    pUC19 Vector (0.1 ng/μl) 10 μl
 
Gesicle Producer 293T Cell Line（Code No. 632617）
Gesicle Producer 293T Cell Line 1 ml
 
■ 保存
Stellar Competent Cells：－80℃
其它：－20℃

Gesicle Producer 293T Cell Line :液氮保存
· 收到產(chǎn)品后，立即將其保存在液氮中。
· 在液氮保存的情況下，立即復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
 
■ 所需要的其它產(chǎn)品（主要產(chǎn)品）
· 0.45 μm 無菌過濾器（cellulose acetate或者polysulfonate）
· 20 ml 無菌注射器
· 50 ml 離心管 (Corning Falcon Cat. No. 352017等)
· 離心機(jī)、擺動轉(zhuǎn)子（50 ml 離心管可以滿足8,000X g離心要求）（例如：離心機(jī)Beckman J2-HS、擺動轉(zhuǎn)子 JS-7.5 swinging bucket rotor）
· 不含氯化鈣和氯化鎂的Dulbecco’s PBS（用于細(xì)胞培養(yǎng)）（Sigma Cat. No. D8537等)
· 細(xì)胞培養(yǎng)液
· 膠原蛋白質(zhì)預(yù)包被培養(yǎng)板
 
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頁面更新：2020-03-05 10:48:39