Lenti-X CRISPR/Cas9 System是一個完整的由慢病毒介導的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括Lenti-X Packaging Single Shots（用于產(chǎn)生高滴度的病毒）和兩個不同的質(zhì)粒載體（用于在靶細胞中表達Cas9 和客戶自定義的sgRNA）。表達sgRNA的質(zhì)粒系統(tǒng)pLVX-hyg-sgRNA1，易于插入客戶自定義的sgRNA 序列，并且該系統(tǒng)提供足夠的質(zhì)粒供客戶構(gòu)建10種不同的sgRNA序列質(zhì)粒。利用慢病毒導入sgRNA和Cas9基因，可以對難轉(zhuǎn)染細胞系實現(xiàn)靶向基因編輯。
Lenti-X CRISPR/Cas9 System涉及到Cas9在靶細胞中的恒定表達，而Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System結(jié)合了Tet-On 3G 反式轉(zhuǎn)錄激活蛋白，這使得用戶可以通過添加強力霉素（doxycycline）來誘導Cas9的表達。通過嚴格控制Cas9的表達，Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System可以使用戶在細胞培養(yǎng)中，減少與Cas9穩(wěn)定表達相關(guān)的毒性與脫靶效應(yīng)。 |
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| ■ 產(chǎn)品特點 |
· 利用病毒導入Cas9 基因和sgRNA ，使得一些難轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞可以實現(xiàn)基因編輯，包括增殖細胞和非增殖細胞。
· Lenti-X Packaging Single Shots易于產(chǎn)生高滴度病毒。
· 由慢病毒介導客戶自定義的sgRNA 和Cas9，用于哺乳動物使用CRISPR/Cas9 技術(shù)進行基因編輯。
· 通過嚴格控制Cas9的表達，Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System可以使用戶在細胞培養(yǎng)中，減少與Cas9穩(wěn)定表達相關(guān)的毒性與脫靶效應(yīng)。
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| ■ 產(chǎn)品應(yīng)用 |
· 利用CRISPR/Cas9技術(shù)對哺乳動物基因組編輯時，以慢病毒為基礎(chǔ)的、用戶自定義sgRNA和 Cas9的導入系統(tǒng)。
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| ■ 實驗例 |
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圖1. 誘導敲除HEK293細胞中CD81基因
Tet-On 3G慢病毒轉(zhuǎn)導靶細胞后采用G418篩選陽性單細胞克隆，選取24個單克隆分析熒光素酶報告基因的誘導表達倍數(shù)，選擇熒光素酶報告基因背景量表達量最低的細胞克隆，然后以Cas9慢病毒（MOI=5）進行轉(zhuǎn)導。轉(zhuǎn)導后的靶細胞以1 μg/ml嘌呤霉素進行篩選，2周后，任意選擇6個穩(wěn)定細胞克隆分析Cas9的誘導表達倍數(shù)。將每個單克隆擴增培養(yǎng)的細胞分別接種至兩個孔（12孔板）進行培養(yǎng)，其中一孔細胞添加0.5 μg/ml強力霉素誘導培養(yǎng)2天。采用抗Cas9的多克隆抗體(Code No. 632607)和ECL試劑通過Western blot分析Cas9誘導表達情況，抗體稀釋比例為1：1,000。從中選取3個Tet-On 3G-Cas9-陽性細胞克隆(C-1, C-2和C-3)進行擴增培養(yǎng)并將其分別接種至2個孔（12孔板）中，CD81-sgRNA慢病毒（MOI=5）再次轉(zhuǎn)導靶細胞，轉(zhuǎn)導8小時后，添加0.5 μg/ml強力霉素至其中一孔進行誘導培養(yǎng)。6天后，收集細胞并采用FITC標記的抗人CD81抗體進行染色，通過FACS檢測CD81表達情況。圖A. Western blot檢測結(jié)果顯示了在添加0.5 μg/ml強力霉素(+)進行誘導或者不添加強力霉素(-)的情況下，6個分別獨立的Tet-On 3G-Cas9-陽性細胞群Cas9蛋白質(zhì)的表達情況。圖B. FACS檢測結(jié)果顯示了CD81-sgRNA慢病毒轉(zhuǎn)導的3個分別獨立的Tet-On 3G-Cas9-陽性293T細胞群，在添加0.5 μg/ml強力霉素(+)進行誘導或者不添加強力霉素(-)的情況下，目的基因的敲除效率。在所檢測的3個細胞群中，其中2個細胞群C-1和C-2在不添加強力霉素進行誘導的情況下基本不發(fā)生基因編輯現(xiàn)象，添加強力霉素進行誘導的情況下CD81基因的敲除效率分別為58.6%和30.7%。而另外一個細胞群C-3在不添加強力霉素進行誘導的情況下仍然會發(fā)生基因編輯現(xiàn)象，CD81基因的敲除效率為27.9%。 |
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圖2. 以可誘導的方式編輯HEK293細胞中AAVS1基因
通過qRT-PCR分析6個Tet-On 3G-Cas9-陽性HEK293穩(wěn)定細胞系中Cas9的誘導表達情況。將HEK293細胞分別接種至2個孔（12孔板），以AAVS1-sgRNA慢病毒（MOI=5）進行轉(zhuǎn)導。轉(zhuǎn)導8小時后，添加0.5 μg/ml強力霉素至其中一孔誘導培養(yǎng)6天。6天后采用Guide-it Mutation Detection Kit (Code No. 631443)檢測AAVS1基因編輯效率。圖A.通過qRT-PCR方法檢測每個細胞克隆分別在未經(jīng)誘導(-Dox)和經(jīng)過誘導(+Dox)的情況下Cas9蛋白質(zhì)的表達情況。未經(jīng)誘導和經(jīng)過誘導的細胞的Ct值和ΔCt值標注在相對應(yīng)一欄，計算出來的表達倍數(shù)差異標注在右側(cè)一欄。多個細胞克隆的檢測結(jié)果顯示，在所檢測的細胞克隆中1號克隆（綠色數(shù)字）具有最好的誘導性能，只有3號克隆（紅色數(shù)字）在沒有強力霉素誘導的情況下Cas9也會有所表達而且誘導性能較差。圖B. Guide-it解離酶分析實驗檢測未經(jīng)誘導(–)和經(jīng)過誘導(+)的細胞克隆中AAVS1基因編輯效率。親本細胞（未轉(zhuǎn)導細胞）檢測結(jié)果顯示未經(jīng)誘導和經(jīng)過誘導的細胞所產(chǎn)生的片段大小是等同的。而經(jīng)過誘導的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的檢測結(jié)果顯示產(chǎn)生了較小的基因片段，這說明在所檢測的細胞克隆中都發(fā)生了AAVS1基因編輯現(xiàn)象。3號克隆在未經(jīng)誘導的情況下也可以觀察到剪切產(chǎn)物，這一點與qRT-PCR檢測結(jié)果是相一致的。 |
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圖3. Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體組成
pLVX-EF1a-Tet3G載體編碼表達Tet-On 3G轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)，由組成型啟動子EF-1 alpha啟動表達。與常用的CMV啟動子相比，EF-1 alpha啟動子在某些細胞類型（包括各種干細胞類型）中不易被沉默，所建立的誘導細胞系適用于長期使用。Tet-On 3G是由Tet-On Advanced轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)修飾而來，具有更高的強力霉素反應(yīng)靈敏度。pLVX-TRE3G-Cas9-puro載體由誘導型啟動子PTRE3GV啟動表達經(jīng)過優(yōu)化的Cas9核酸酶。pLVX-TRE3G-Cas9-puro載體上的Cas9序列來源于桿菌屬釀膿鏈球菌，進行了密碼子優(yōu)化以適用于哺乳動物細胞表達，另外在Cas9序列C端還引入了核定位信號（NLS）。pLVX-hyg-sgRNA1載體由組成型人U6啟動子編碼表達sgRNA(由用戶設(shè)計并插入)。 |
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圖4.為可誘導型基因編輯選擇優(yōu)質(zhì)的細胞克隆
通過分析Cas9表達情況或者分析未誘導的或者經(jīng)過誘導的細胞群基因編輯情況來篩選優(yōu)質(zhì)的細胞克隆。雖然通過Western blot檢測Cas9蛋白質(zhì)表達情況有助于預篩選細胞克隆，但是CRISPR/Cas9介導的基因編輯是非常高效的，即使在通過Western blot檢測不到Cas9蛋白質(zhì)表達的情況下，在相應(yīng)的細胞克隆中仍然有可能發(fā)生基因編輯現(xiàn)象。我們建議通過qRT-PCR方法來篩選Cas9背景表達量較低的細胞克隆，以避免在沒有添加強力霉素的情況下發(fā)生基因編輯現(xiàn)象。圖4上面一行顯示的是優(yōu)質(zhì)細胞克隆(C-1)的檢測數(shù)據(jù)，經(jīng)過誘導的C-1細胞中Cas9蛋白質(zhì)表達情況良好（Western blot,+），Cas9 mRNA背景表達水平非常低(qRT-PCR)。和未經(jīng)誘導的細胞（-或者-Dox）相比，經(jīng)過誘導的細胞（+或者+Dox）中Cas9的誘導表達使得基因編輯發(fā)生的頻率更高，解離酶分析實驗中小片段（藍色箭頭）的出現(xiàn)，F(xiàn)ACS檢測結(jié)果顯示較大比例的細胞出現(xiàn)在“knockout”范圍而未經(jīng)誘導的細胞中基因編輯水平非常低都可以證實這一點。圖4下面一行顯示的是非優(yōu)質(zhì)細胞克隆(C-3)的檢測數(shù)據(jù)，在未經(jīng)誘導的細胞克?。?）中即使通過Western blot沒有檢測到Cas9蛋白質(zhì)的表達，但依然可以檢測到Cas9 mRNA的表達（qRT-PCR）和基因編輯現(xiàn)象（解離酶,FACS）。 |
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| 圖5. LVX-hyg-CD81-sgRNA轉(zhuǎn)導Jurkat或者HT1080細胞后采用潮霉素篩選穩(wěn)定整合細胞系。之后采用LVX-puro-Cas9轉(zhuǎn)導篩選獲得的穩(wěn)定細胞克隆，并采用嘌呤霉素再次進行篩選，通過FACS方法檢測CD81敲除效率。以抗CD81抗體處理的未經(jīng)Cas9轉(zhuǎn)導的親代細胞作為陽性對照，而未做抗體處理的親代細胞作為陰性對照。 |
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圖6. 誘導敲除Jurkat細胞中CD81基因
按照實驗手冊操作流程建立Cas9背景表達較低的Tet-On 3G-Cas9-陽性Jurkat細胞，并以CD81-sgRNA慢病毒（MOI=5）連續(xù)轉(zhuǎn)導兩次。將成功轉(zhuǎn)導的細胞接種至2個孔（12孔板）中并在其中一孔中添加0.5 μg/ml強力霉素(+Dox)誘導培養(yǎng)7天。采用FITC抗人CD81抗體進行檢測并通過FACS進行分析，分析結(jié)果顯示在未經(jīng)強力霉素誘導的細胞（-Dox; top）中只有一小部分的細胞（0.4%）發(fā)生了基因編輯現(xiàn)象，而經(jīng)過強力霉素誘導的細胞(+Dox; bottom)中發(fā)生CD81基因編輯的比例為32%。 |
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| ■ 產(chǎn)品組份 |
Lenti-X CRISPR/Cas9 System (Code No.632629)
· pLVX-hyg-sgRNA1 Vector (Linear) (Code No. 632632，不單獨銷售)
· pLVX-puro-Cas9 Vector(Code No. 632631)
· Stellar Competent Cells(Code No. 636763)
· Guide-it Ligation Components v2 (Code No. 632615，不單獨銷售)
· Lenti-X Packaging Single Shots(Code No. 631275，不單獨銷售)
Lenti-X Tet-On 3G CRISPR/Cas9 System (Code No. 632633)
· pLVX-hyg-sgRNA1 Vector (Linear)
· pLVX-TRE3G-Cas9-puro Vector Set
· pLVX-EF1a-Tet3G Vector
· Stellar Competent Cells
· Guide-it Ligation Components v2
· Lenti-X Packaging Single Shots
pLVX-hyg-sgRNA1 Vector System (Code No. 632630)
· pLVX-hyg-sgRNA1 Vector (Linear) (Code No. 632632，不單獨銷售)
· Guide-it Ligation Components v2 (Code No. 632615，不單獨銷售)
· Stellar Competent Cells(Code No. 636763) |
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京公網(wǎng)安備 110114000405號
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